能耐一定程度的脱水

  第4章 人工种子与植物脱毒 ? 人工种子的概念和研制的意义 ? 人工种子技术 ?离体繁殖体培养 ?人工种子的包埋技术 ?人工种子的贮藏 ? 人工种子的应用前景 人工种子(Artificial seeds) ? 任何一种经人工种皮包被或裸露的,具有形 成完整植株能力的繁殖体均可称之为人工种 子。 ?胚状体或不定芽 ? 人工种子亦称体细胞种子(somatic seeds), 又称合成种子(synthetic seeds) 。 人工种子的种类 根据包被的程度可将人工种子分为三大类: 裸露的或休 眠的繁殖体 人工种皮包 被的繁殖体 水凝胶包被 的繁殖体 人工种子的研究状况 1978年,英国Murashige首先提出人工种子。 欧洲列入尤里卡计划、日本和美国列入优先 发展生物技术计划。我国1987年将其列入国 家高技术研究与发展计划。据报道,目前已 对26个科,36个属的植物进行了人工种子研 究。其研究范围显示出两大特点: 1.经济作物和粮食作物的人工种子日益增多 2.以微器官作为繁殖体的报道日益增多,其 中包括微芽、微枝、原球茎、小鳞茎、小 块茎。 以器官为繁殖体的人工种子 繁殖体 印度桑(Morus indica) 芽 檀香(Santalum ablum) 芽 花叶芋(Caladium bicolor) 芽 百合(Lilium) 小鳞茎 直杆桉树(E. maideni) 侧芽 莴苣(Lacyuca sativa) 芽 华腺萼木(Mycetia sienensis) 微芽 大花蕙兰(Cytobium) 原球茎 石槲兰(Dendrobium) 原球茎 唐菖蒲(Gladiolus hortalans) 球茎 香蕉(musa acuminata) 微芽 杨树(Popupus beijingy) 芽 物种 主要结果 无菌条件下发芽成苗 无菌条件下发芽成苗 无菌条件下发芽成苗 无菌条件下发芽成苗 无菌条件下发芽成苗 无菌及有菌下发芽成苗 有菌土壤中发芽成苗 无菌条件下发芽 无菌条件下发芽 无菌条件下发芽 无菌条件下发芽 无菌条件下发芽 以体细胞胚为繁殖体的人工种子 物种 胡萝卜(Daucus carota) 苜蓿(Medicago sativas) 芹菜(Apium graveolens) 柑橘(C. sinensis×C. reticulata) 挪威云杉(Picea abies) 松树(Pinus lambertiana,P. aeda) 玉米(Zea mays) 杂交水稻(O. sativa×O. lalifolia) 橡胶树(Hevea brasiliensis) 西洋参(Panax quinquefolium) 刺五加(A. senticosus) 黄连(Coptis chinensis) 主要结果 有菌土壤中发芽成苗 有菌条件下发芽成苗 有菌条件下发芽成苗 无菌条件下发芽成苗 无菌及有菌条件下发芽 无菌及有菌条件下发芽 无菌条件下发芽成苗 无菌条件下发芽 无菌条件下发芽 无菌条件下发芽 无菌及有菌条件下成苗 无菌及有菌条件下成苗 人工种子研制的意义 ? 人工种子结构完整,体积小,便于贮藏与运 输,可直接播种,易于机械化操作; 多,繁殖快、有利于工厂化生产; ? 不受季节限制,不受环境制约,胚状体数量 ? 有利于繁殖生育周期长、自交不亲和、珍贵 稀有的一些植物,也可大量繁殖无病毒材料; 成分,提高种子活力; 种优势。 ? 可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等 ? 体细胞胚由无性繁殖体系产生,可以固定杂 人工种子技术 繁殖体的培养技术 人工种子对体细胞胚繁殖体的要求 作为人工种子繁殖体的体细胞胚,其基本要 求是要具有发育上的同步性(如何诱导), 还必需满足如下标准特征: ※ 形态正常,具有完整的胚结构。 ※ 与母体植物的基因型基本相同,特别是在 重要经济性状和农艺性状上没有变异。 ※ 具有较好的成熟性,能耐一定程度的脱水。 其次,作为实用化的体 细胞胚种子还必须满足 一定的数量需求,规模 化生产是其基本前提。 Choi等(2002)建立了 人参体细胞胚大规模液 体培养体系,每500ml容 器可生产体细胞胚 12,000个。在体细胞发 育至子叶期早期,将期 转入1/2MS无机盐加9% 蔗糖的培养基中诱导, 获得了良好效果。 微型营养器官繁殖体的培养 温度 马铃薯-18-20℃ 马 铃 薯 块 茎 地黄根茎 光照 马铃薯-短 培养基渗透压 马铃薯-8%蔗糖 激素 与内源激素水平 变化和平衡有关 半夏块茎 芽繁殖体的培养 ? 大多数情况下,微芽、不定芽的培养往往直接 从外植体上直接诱导形成,培养方式简单,且勿需 高浓度的激素处理,因此所产生的繁殖体基本保持 了原有植物的品种特性。 ? 根据植物类型不同,可选择不同的外植体作为 芽发生的来源: 非洲紫罗兰一般选用叶片为外植体,诱导不 定芽作为微繁殖体; 榆树类植物则可选根作为外植体产生微芽; 石竹类花卉可以茎尖为外植体培养侧芽作为 繁殖体 部分植物繁殖体诱导培养条件 种 类 芥 菜 型 油 菜 LH,水解乳蛋白 Ade,腺嘌呤 桉 树 兰 花 激素浓度 (mg/L) 繁殖 程序及 培养基 其它 和蔗糖 2,4 NAA ZT BA KT (mg/L) 体 时间 (g/L) -D Step I MS, LH, .1 .0 .0 2 1 1 21 30 100 体细 - 1.0 LH, 胞胚 Step II MS, .1 0.06 . 0 0 5 21 30 0.2 100 MS, 微芽 21 5.0 30 Step I B5, 2.0Ade, 1.0 20 40-50 4.0 40 体细 0.2Ade, 胞胚 Step II 改良H, . 0 5 28-56 30 0.5 40 改良H, 0.20.5微芽 25 30 0.5 2.0 原球 椰子 MS, .1 25 0 20 茎 汁 繁殖体的包埋 ? 繁殖体的预处理 ?体细胞胚的后熟培养与脱水干燥 ?微型器官繁殖体适度脱水与表面消毒处理 以及必要时的强制休眠处理 人工种皮 ? 分内种皮和外种皮 ? 对人工种皮的要求:具有保护胚的功能,并 且无毒性、通气好、抗污染、抗压性好、不 粘连、适于贮藏和运输。 ? 内种皮:聚氧乙烯、海藻酸钠、明胶、琼脂 等。 ? 外种皮常用材料: ? Elvax 4260(乙烯、乙烯基乙酸和丙烯酸 共聚物,1987,美国)涂膜,价高,操作 复杂,效果不佳。 ? Tullanox和Cab-0-sil(二氧化硅化合 物),以粉末状包裹在人工种子胶囊外层, 操作时只需将胶囊在材料中滚动即可。 ? 硅酮种衣,能抗真菌,渗入水蒸汽和氧 气,处于试验之中。 人工胚乳 ? 成分:无机盐混合物、碳水化合物(糖和淀 粉)、蛋白质。 ? 糖分存在容易导致微生物感染而腐烂,所以 人工胚乳中也要加入防腐剂、抗菌素、农药 等。 ? 人工胚乳添加的两条途径: ? 直接法 ? 微型包裹法 包埋技术 ? 干燥法 聚氧乙烯干燥法包埋是最早的人工种子包埋 技术,即将胚状体置于23℃、相对湿度70%的 黑暗条件下逐渐干燥,然后用聚氧乙烯包裹 胚状体。 ? 液胶包埋法 胚状体不经干燥包埋,直接与流体胶混合后 播入土中。应用此法,胚成活率低,常因干 燥而死亡。 包埋技术 Flash ? 水凝胶法 是最常用的一种方法。 即用海藻酸钠等水溶性 凝胶经与钙离子进行离 子交换后凝固,用于包 埋单个胚状体。种子硬 度由凝胶浓度与络合物 离子交换时间决定。 ? CaCl2浓度:2.0%-2.5% ? 离子交换时间:20min- 30min ? 无菌水漂洗20min 植物人工种子的成苗率 繁殖体 海藻酸钠 培养基及 (%) 蔗糖浓度 激素 (mg/L) 成苗率 (%) 30-70 (无菌) 四会贡柑体 细胞胚 唐菖蒲小球 茎 热带兰花球 茎 赤桉微芽 3 4-5 4 4 GA(1), MT,4% IBA(0.25) MS, IBA(0.5), 1.5% GA(0.1) 改良MS, NAA(1.0), 3% BA(0.2) NAA 改良SH, 3% (0.2-0.5) 93 95 80-90 贮藏 ? 贮藏条件:4~7℃低温、相对湿度小于67% ? 贮藏中存在的问题: ? 种胚质量不高、后期停止生长、胚腐烂、种子 失水干缩等。 ? 解决措施: ? 胚乳中添加防腐剂、抗生素、控制糖含量、低 温贮藏,种皮外包裹滑石粉、液体石蜡等成分。 人工种子的发展和应用前景 ? 人工种子可能最先用于无性繁殖植物 ? 微芽,试管块茎、鳞茎等作繁殖体时,成苗 率高且出苗整齐,具有田间应用的可行性, 同时,离体培养的繁殖体可完全去除病原物。 ?传统上的试苗由于体积大、对携带储运条件 要求苛刻因而限制了使用规模。如果利用人 工种子将可能首先实现无性繁殖植物种子生 产的彻底革命。 1. 以微芽为繁殖体的人工种子技术,有可 能首先在无性繁殖的果树、花卉、林木等 植物中得以应用。 人工种子的发展和应用前景 2. 微器官人工种子可用于天然种子繁殖后代群 体变异大的植物 ? 有些植物如桉树,虽然能够用天然种子繁殖, 但种子繁殖的植株变异大,树体不整齐。 ? 微芽试管苗繁殖技术已在生产上显示了树体整 齐的优越性,目前以微芽为繁殖体的人工种子 技术已经建立。 ? 桉树人工种子在土壤中的成苗率已可达80%以 上,且树体十分整齐。 人工种子的发展和应用前景 ? 以体细胞胚为繁殖体应用的局限性及可能性 ?以花或果实为经济产品的多年生植物如果树有可 能出现较长的幼年期,使开花结果推迟,且还可 能出现果实不整齐的现象。 ?以营养器官或木材为产品的植物中,对性状一致 性要求不严格的植物中,体细胞胚繁殖体具有其 它繁殖体不可替代的优越性。 人工种子的发展和应用前景 ? 以体细胞胚为繁殖体应用的局限性及可能性 ?容易建立生产工艺,已经具备高质量的体细 胞胚胎发生技术体系的植物,如苜蓿、胡萝 卜等。 ?不具备或不完全具备高质量体细胞胚胎发生 体系,商品价值较高,但许多种类育性不佳, 繁殖困难,或者生产杂种费用昂贵。 ?比较容易建立生产工艺,具备完善的胚胎发 生技术体系,经济价值也很高。咖啡、玉米 等。 存在问题 ? 许多重要的植物目前还不能靠组织培养快速 产生大量的、出苗整齐一致的、高质量的体 细胞胚或不定芽。 ? 包埋剂的选择及制作工艺方面尚需改进,以 提高体胚到正常植株的转化率,并达到加工 运输方便、防干防腐耐贮藏的目的。 ? 如何进行大量制种和大田播种,实现机械化 操作等方面配套技术尚需进一步研究。 小结 ? 人工种子是在实验室人工控制条件下生产的 繁殖体。 ? 人工种子繁殖体包括体细胞胚、微型器官和 微芽,根据植物种类不同可适当选择。 ? 人工种子应用的基本条件是繁殖体的工厂化 生产和配套技术的成熟。 ? 无性繁殖植物的人工种子有望最先得以应用。 思考题 ? 人工种子的概念和类型。 ? 人工种子对体细胞胚繁殖体有什么要求? ? 目前人工种子生产中需要解决的主要技术问 题。 ? 目前人工种子最适于在哪些方面应用? 植物离体培养脱毒技术 ? 病毒在植物体内的分布及危害 ? 植物脱病毒方法 ? 脱毒植物检测及保存 病毒的特性及其对植物的危害 ? 大多数植物病毒不经种子传播; ? 无性繁殖的植物,都易受到一种或多种病 毒的侵染。 植物种类 染病毒种类 19 菊花 11 康乃馨 4 水仙 10 月季 26 葡萄 5 无花果 植物种类 矮牵牛 马铃薯 大蒜 苹果 草莓 桃 染病毒种类 5 17 24 36 24 23 苹果锈果病 薄荷病毒病病 郁金香杂色花 郁金香正常花 病毒在植物体内的分布 ? 病毒在植物体内的分布具有不均匀性,随 植株不同部位和年龄而异。 ?老叶和成熟组织及器官中病毒含量较高 ?根尖、茎尖生长点约0.1~1mm区域内,几 乎不含病毒。 (原因?) (原因:分生组织细胞分裂和生长速度 快,而病毒在植物体细胞内繁殖速度相 对较慢;另外,病毒是通过筛管组织或 胞间联丝传播至其他组织细胞的,而茎 尖分生组织无分化,没有维管组织。) 病毒在植物体内的分布具有不均匀性的理 论假说 (1) 能量竞争 病毒核酸和植物细胞分裂时DNA合 成均需要消耗大量的能量,而分生组织细胞本 身很活跃,其DNA合成是自我提供能量自我复制, 而病毒核酸的合成要靠植物提供能量来自我复 制,因而就得不到足够的能量,从而就抑制了 病毒核酸的复制。 (2) 传导抑制 病毒在植物体内的传播主要是通过 维管束实现的,但在分生组织中,维管组织还 不健全,从而抑制了病毒向分生组织的传导。 (3) 激素抑制 在分生组织中,生长素和 细胞分裂素水平均很高,因而阻滞了病 毒的侵入或者抑制病毒的合成。 (4) 酶缺乏 1969年,Stace-Smith提出, 可能病毒的合成需要的酶系统在分生组 织中缺乏或还没建立,因而病毒无法在 分生组织中复制。 (5) 抑制因子 1976年,Martin-Tanguy等 提出了抑制因子假说,认为在分生组织 中存在有某种抑制因子。 植物脱病毒方法 物理方法 化学方法 生物方法 高温处理 珠心培养 愈伤脱毒 热处理脱毒 茎尖培养 微体嫁接 热处理脱毒法 ? 原理 ①热处理不能杀死病毒,只能钝化病毒的活 性,使病毒在植物体内增殖减缓或停止, 而失去侵染能力; ②作为一种物理效应可以加速植物细胞的分 裂,使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取 胜。 热处理脱毒法 ? 愈伤组织热处理法 ?从患病植株上取叶片(茎片、鳞片、花 器等)进行离体培养,诱导形成愈伤组 织,然后将愈伤组织反复继代培养同时 兼用热处理。 ?常用的温度及处理时间 ? ? 37℃ ~ 38℃(2、4或8周) 50℃(3~15min) ? 热空气处理脱毒法 ?将试验母株在高温生长室中生长一 个阶段,使其顶端分生组织和次生 分生组织迅速生长,然后切取其茎 尖分生组织进行离体培养。 ?生长室温度(35℃ ~40℃) ?光照强度(3000~10000Lx) 愈伤组织继代兼热处理钝化TMV和CMV获 得烟草无病毒植株的效果 继代 无烟草花叶病毒(TMV) 无黄瓜花叶病毒(CMV) 次数 25℃ 30℃ 37℃ 25℃ 30℃ 37℃ 0 1 2 3 4 5 0/20 0/20 0/20 0/20 0/20 4/20 — 0/20 0/20 0/20 0/20 1/20 — 0/20 0/20 8/20 5/20 5/20 8/21 -5/18 4/19 8/20 10/20 10/20 8/20 -10/21 11/20 11/20 结论: 病毒种类不同,愈伤组织反复继代兼热处理的效果 不同;TMV、CMV均经37℃热处理,脱毒效果最好。 ?其它效果 ? 香石竹(康乃馨)在38℃~40℃下经两个 月处理可除去全部病毒。 马铃薯在37℃下处理10~20天能除去卷叶 病毒。 热处理脱毒法 ? 优点 方法简单,效果明显。 ? 缺点 ①具有局限性,不能去除所有病毒。只 对圆形病毒(苹果花叶病毒),或对线 状病毒(马铃薯卷叶病毒)有效;而对 杆状病毒(千日红病毒)无效。 ②极易使植物材料受热枯死,造成损失 茎尖培养脱毒法 ? 依据 ? 原理 康乃馨不同大小茎尖与康乃馨斑驳病 毒的脱毒效果 茎尖 大小 (mm) 0.1 0.25 0.5 0.75 1.0 1.0 培 养 数 3 20 30 9 4 5 荆芥鉴定之病斑 总病斑 接种叶数 平均病斑数/叶 无病毒茎尖 数目 % 2 8 4 1 0 0 66 40 13 11 0 0 3 137 1198 429 432 1972 13 61 70 12 11 20 0.2 2.2 17.1 35.3 39.2 98.6 影响茎尖培养法脱除植物病毒的因素 ? 母体材料病毒侵染的程度 ? 外植体的生理状态 ? 起始培养的茎尖大小 茎尖培养法脱除植物病毒的技术关键 茎尖越小对培 养基的要求越 高,成功率越 低。 微体嫁接法(micrografting) ? 应用微体嫁接的原因: 木本植物茎尖培养难以生根形成植株。 ? 具体做法: 将极小的茎尖(0.14mm~1.0mm)作为接 穗嫁接到不带病毒的种子实生苗砧木上, 然后将砧木、接穗一起在培养基上培养。 ? 优点: 接穗在砧木上易成活,故可用很小的茎尖 来培养,去除病毒几率大,获得无病毒苗 的可能性大。 ? 苹果茎陷病毒的茎尖培养脱毒 ?接穗: 0.2mm茎尖 ?砧木:无菌实生苗的胚轴(带两片子叶) ?方法:劈接法将接穗插入两片子叶之间的 组织中 微体嫁接法(micrografting) 脱除病毒的关键: ①要求剥离技术很高 ②需要考虑砧木和接 穗对营养组成的不 同要求; ③与接穗的取材季节 有密切关系(苹果 4~6月取材嫁接成 活率较高。) 珠心组织培养脱毒法 ? 依据: 病毒通过维管组织传播,而珠心组织(孢 子体部分)与维管组织没有直接联系,故 可以通过珠心组织培养获得无病毒植株。 ? 目前已用该方法去除了柑橘银屑病、叶脉 突出病、柑橘裂皮病、速衰病等病毒。 ? 该方法的缺点: 存在20%~30%左右的变异率,无病毒苗 苗期较长。柑橘要6~8年才能结果。 胚珠 愈伤组织培养脱毒法 ? 通过植物器官或组织诱导产生愈伤组织,然后 从愈伤组织再诱导分化芽,长成植株,可以获 得脱毒苗,这在天竺葵、马铃薯、大蒜、草莓、 枸杞等植物上已先后获得成功。利用诱导各器 官愈伤组织培育无病毒苗的机制,可能有如下 几种: (a)病毒在植株体内不同器官或组织分布不均 (b)病毒复制能力衰退或丢失; (c)继代培养的愈伤组织抗性变异。 检测方法 直接观察 血清鉴定法 电镜鉴定法 生物鉴定法 分子检测法 几种马铃薯病毒病的症状 血清鉴定法(serologic test) ? 实验依据:沉淀反应 ? 植物病毒“抗血清”在植物病毒诊断中优点: 病毒抗血清具有高度专化性: ①专一性;②“预见性”;③定量性。 ? 病毒抗血清在诊断上的局限性: ? 不是所有病毒都能制成抗血清 能够提纯的病毒量太少,或在提纯过程中丧失 了必备的抗原结构; 植物体内的单宁物质使病毒丧失了抗原性质。 血清鉴定法 ? 基本方法: ? 玻璃片凝集法 (平皿)微量凝集试验 试 管沉淀反应 免疫双扩散 ? ELISA 病毒感染 动物 动物 免疫球蛋白 (抗体) + 带该种病毒 植物 人工注射 异体蛋白 (抗原) 血清反应 (抗原) 生物鉴定法(指示植物鉴定) ? 依据: 指示植物对病毒极为敏感,一旦感染病毒就会在 叶片或全株上表现出特有的病斑。 ? 指示植物: 对环境中的一个因素或各因素的综合条件具有指示 作用的植物种 指示植物分类: ①接种后产生的症状可扩散到非接种部位。 ②只在接种部位产生明显病斑。 ? 优点: 操作方便,条件简单,经济有效;还可以根据病毒 的寄生范围,确定几种指示植物,准确性强。 生物鉴定法 ? 接种方法 ①摩擦接种法 取待检查植株叶片,经处理后用其汁液和金刚 砂混合,轻轻摩擦指示植物叶片,使汁液能侵 入叶片表皮细胞但又后,观察指示植物有无病 毒感染症状。 ? 马铃薯X病毒侵染千日红 (叶片呈枯斑) ? 马铃薯M病毒侵染千日红 (叶片呈突起枯斑) ②嫁接法 一些木本多年生果树或草莓等无性 繁殖草本植物,其病毒不是通过汁液 而是其他介体传播[如草莓黄化病毒是 由蚜虫(Mtzus fragaefolii)传播的, 这种病毒鉴定可采用嫁接法,即用鉴 定植株芽作接穗,指示植物作砧木。 根据指示植物的表现判断是否脱除了 病毒。 电镜检查法 ? 直接观察,检查是否有病毒颗粒。 ? 优点:准确,有效 ? 不足:需要一定的设备和技术(超薄切片 技术、背景染色法、扫描电镜使用)。 分子检测法 ? 优点:快速、简便、灵敏度高和特异性强。 ? 常用的方法 ? 聚合酶链式反应(PCR) ? 双链RNA分析技术 ? 核酸分子杂交和序列分析技术 ? RFLP、RAPD等分子标记技术 无病毒原种的保存与繁殖 ? 无病毒原种的保存 可利用隔离法进行保存。 ? 无病毒原种的繁殖 建立一套严格的良种繁育制度,生产场 所做好土壤消毒和防昆虫工作,保持无 病毒原种材料质量。 脱毒苗保存 思考题 1.利用茎尖分生组织培养脱除去植物病毒的 原理。 2.哪些因素会影响茎尖培养的脱毒效果? 3. 如何检测脱毒效果? 4. 基本概念

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